Produkte
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR-Nachweiskit für 2019-nCoV
Erwartete Nutzung
Dieses Kit wird für den qualitativen Nachweis des neuen Coronavirus (2019-nCoV) mithilfe von Rachenabstrichen, Nasopharynxabstrichen, bronchoalveolärer Spülflüssigkeit und Sputum verwendet. Das Nachweisergebnis dieses Produkts dient nur der klinischen Referenz und sollte nicht als einziges verwendet werden Beweise für die klinische Diagnose und Behandlung. Eine umfassende Analyse der Erkrankung wird in Kombination mit den klinischen Manifestationen des Patienten und anderen Labortests empfohlen.
Inspektionsprinzip
Das Kit basiert auf der One-Step-RT-PCR-Technologie.Tatsächlich wurden die ORF1ab- und N-Gene des neuen Coronavirus 2019 (2019-nCoV) als Amplifikationszielregionen ausgewählt.Spezifische Primer und Fluoreszenzsonden (N-Gensonden sind mit FAM und ORF1ab-Sonden mit HEX markiert) sollen die RNA des neuartigen Coronavirus 2019 in Proben erkennen.Das Kit enthält außerdem ein endogenes internes Kontrollerkennungssystem (mit CY5 markierte interne Kontrollgensonde), um den Prozess der Probenentnahme sowie der RNA- und PCR-Amplifikation zu überwachen und so falsch negative Ergebnisse zu reduzieren.
Hauptbestandteile
| Komponenten | Volumen（48Z/Satz） |
| RT-PCR-Reaktionslösung | 96µl |
| nCOV-Primer-TaqMan-Sondenmischung (ORF1ab, N-Gen, RnaseP-Gen) | 864 µl |
| Negativkontrolle | 1500 µl |
| nCOV-Positivkontrolle (ORF1ab-N-Gen) | 1500 µl |
Eigene Reagenzien: RNA-Extraktions- oder Reinigungsreagenzien.Negativ-/Positivkontrolle: Die Positivkontrolle ist RNA, die das Zielfragment enthält, während die Negativkontrolle nukleinsäurefreies Wasser ist.Während des Gebrauchs sollten sie an der Extraktion beteiligt sein und als infektiös gelten.Sie sollten gemäß den einschlägigen Vorschriften gehandhabt und entsorgt werden.
Das interne Referenzgen ist das menschliche RnaseP-Gen.
Lagerbedingungen und Verfallsdatum
-20 ± 5 ℃, wiederholtes Einfrieren und Auftauen mehr als 5 Mal vermeiden, gültig für 6 Monate.
Anwendbares Instrument
Mit FAM / HEX / CY5 und anderen Mehrkanal-Fluoreszenz-PCR-Instrumenten.
Probenanforderungen
1.Anwendbare Probentypen: Rachenabstriche, Nasopharynxabstriche, bronchoalveoläre Spülflüssigkeit, Sputum.
2. Probenentnahme (aseptische Technik）
Rachenabstrich: Wischen Sie die Mandeln und die hintere Rachenwand mit zwei Tupfern gleichzeitig ab und tauchen Sie dann den Tupferkopf in ein Reagenzglas mit der Probenlösung
Auswurf: Nachdem der Patient einen starken Husten hat, sammeln Sie den abgehusteten Auswurf in einem Reagenzglas mit Schraubverschluss, das die Probenlösung enthält.bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit: Probenahme durch medizinisches Fachpersonal.3. Lagerung und Transport von Proben
Proben zur Virusisolierung und RNA-Testung sollten so schnell wie möglich getestet werden.Proben, die innerhalb von 24 Stunden nachgewiesen werden können, können bei 4℃ gelagert werden;diejenigen, die nicht innerhalb von 24 erkannt werden können
Stunden sollten bei -70℃ oder darunter gelagert werden (wenn keine Lagerbedingungen von -70℃ vorliegen, sollten sie es sein).
vorübergehend bei -20℃ im Kühlschrank gelagert).Während des Transports sollten die Proben wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden.Die Proben sollten so schnell wie möglich nach der Entnahme an das Labor geschickt werden.Wenn Proben über weite Strecken transportiert werden müssen, empfiehlt sich die Lagerung in Trockeneis.
Testmethoden
1 Probenverarbeitung und RNA-Extraktion (Probenverarbeitungsbereich)
Es wird empfohlen, 200 μl flüssige Probe für die RNA-Extraktion zu entnehmen.Informationen zu den entsprechenden Extraktionsschritten finden Sie in den Anweisungen der kommerziellen RNA-Extraktionskits.Sowohl das Negative als auch das Negative
Die in diesem Kit enthaltenen Kontrollen waren an der Extraktion beteiligt.
2 PCR-Reagenzienvorbereitung (Reagenzienvorbereitungsbereich)
2.1 Nehmen Sie alle Komponenten aus dem Kit, tauen Sie sie auf und mischen Sie sie bei Raumtemperatur.Vor Gebrauch einige Sekunden bei 8.000 U/min zentrifugieren;Berechnen Sie die erforderliche Menge an Reagenzien und bereiten Sie das Reaktionssystem wie in der folgenden Tabelle gezeigt vor:
| Komponenten | N-Portion (25µl-System) |
| nCOV-Primer-TaqMan-Sondenmischung | 18 µl × N |
| RT-PCR-Reaktionslösung | 2 µl × N |
| *N = Anzahl der getesteten Proben + 1 (Negativkontrolle) + 1 (nCOVPositive Kontrolle) | |
2.2 Nach gründlichem Mischen der Komponenten kurz zentrifugieren, damit die gesamte Flüssigkeit von der Röhrchenwand auf den Boden des Röhrchens fallen kann, und dann das 20-µl-Amplifikationssystem in das PCR-Röhrchen aliquotieren.
3 Probenahme (Probenvorbereitungsbereich)
Nach der Extraktion 5 μl der Negativ- und Positivkontrolle hinzufügen.Die RNA der zu untersuchenden Probe wird in das PCR-Reaktionsgefäß gegeben.
Verschließen Sie das Röhrchen fest und zentrifugieren Sie es einige Sekunden lang bei 8.000 U/min, bevor Sie es in den Amplifikationserkennungsbereich überführen.
4 PCR-Amplifikation (amplifizierter Nachweisbereich)
4.1 Platzieren Sie das Reaktionsgefäß in der Probenzelle des Instruments und stellen Sie die Parameter wie folgt ein:
| Bühne | Zyklus Nummer | Temperatur(°C) | Zeit | SammlungWebsite |
| UmkehrenTranskription | 1 | 42 | 10 Minuten | - |
| Vordenaturierungn | 1 | 95 | 1 Minute | - |
| Zyklus | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30er Jahre | Datensammlung |
Auswahl des Geräteerkennungskanals: Wählen Sie den FAM、HEX、CY5-Kanal für das Fluoreszenzsignal.Als Referenz fluoreszierend NONE, bitte nicht ROX wählen.
5 Ergebnisanalyse (Informationen zur Einstellung finden Sie in den experimentellen Anweisungen des jeweiligen Instruments.)
Speichern Sie die Ergebnisse nach der Reaktion.Passen Sie nach der Analyse den Startwert, den Endwert und den Schwellenwert der Basislinie entsprechend dem Bild an (der Benutzer kann die Anpassung entsprechend der tatsächlichen Situation vornehmen, der Startwert kann auf 3 bis 15 eingestellt werden, der Endwert kann auf eingestellt werden). 5~20, Anpassung) im logarithmischen Diagramm. An der Schwelle des Fensters befindet sich die Schwellenlinie in der logarithmischen Phase und die Verstärkungskurve der Negativkontrolle ist eine gerade Linie oder liegt unterhalb der Schwellenlinie.
6 Qualitätskontrolle (Eine Verfahrenskontrolle ist im Test enthalten) Negativkontrolle: Keine offensichtliche Amplifikationskurve für FAM-, HEX- und CY5-Detektionskanälen
COV-Positivkontrolle: offensichtliche Amplifikationskurve der FAM- und HEX-Detektionskanäle, Ct-Wert ≤ 32, aber keine Amplifikationskurve des CY5-Kanals;
Die oben genannten Anforderungen müssen gleichzeitig im selben Experiment erfüllt sein;Andernfalls ist das Experiment ungültig und muss wiederholt werden.
7 Ermittlung der Ergebnisse.
7.1 Wenn in den FAM- und HEX-Kanälen der Testprobe keine Amplifikationskurve oder kein Ct-Wert > 40 vorhanden ist und im CY5-Kanal eine Amplifikationskurve vorhanden ist, kann davon ausgegangen werden, dass kein 2019 neues Coronavirus (2019-nCoV) vorliegt. RNA in der Probe;
.2 Wenn die Testprobe offensichtliche Amplifikationskurven in den FAM- und HEX-Kanälen aufweist und der Ct-Wert ≤40 beträgt, kann davon ausgegangen werden, dass die Probe positiv für das neue Coronavirus 2019 (2019-nCoV) ist.
7.3 Wenn die Testprobe nur in einem Kanal von FAM oder HEX eine klare Amplifikationskurve aufweist, der Ct-Wert ≤40 beträgt und im anderen Kanal keine Amplifikationskurve vorhanden ist, müssen die Ergebnisse erneut getestet werden.Wenn die Ergebnisse des erneuten Tests konsistent sind, kann die Probe als positiv für die neue Probe beurteilt werden
Coronavirus 2019 (2019-nCoV).Wenn das Ergebnis des erneuten Tests negativ ist, kann davon ausgegangen werden, dass die Probe negativ für das neue Coronavirus 2019 (2019-nCoV) ist.
Positiver Beurteilungswert
Die ROC-Kurvenmethode wird verwendet, um den Referenz-CT-Wert des Kits zu bestimmen, und der Referenzwert der internen Kontrolle beträgt 40.
Interpretation der Testergebnisse
1.Jedes Experiment sollte auf negative und positive Kontrollen getestet werden.Testergebnisse können nur ermittelt werden, wenn die Kontrollen die Qualitätskontrollanforderungen erfüllen
2.Wenn die FAM- und HEX-Erkennungskanäle positiv sind, kann das Ergebnis des CY5-Kanals (interner Kontrollkanal) aufgrund der Systemkonkurrenz negativ sein.
3. Wenn das Ergebnis der internen Kontrolle negativ ist und die FAM- und HEX-Erkennungskanäle des Reagenzglases ebenfalls negativ sind, bedeutet dies, dass das System deaktiviert oder der Vorgang falsch ist und der Test ungültig ist.Daher müssen die Proben erneut getestet werden.
